Visualisasi Prinsip Kerja Elektroforesis Kapiler ABI 3100: Empat kapiler simultan dan titik deteksi laser.
Applied Biosystems (ABI) 3100 Genetic Analyzer bukan sekadar instrumen laboratorium; ia adalah tonggak penting dalam sejarah genomika. Dirilis pada saat kebutuhan akan otomatisasi dan throughput yang lebih tinggi menjadi mendesak, ABI 3100 menawarkan solusi empat kapiler yang efisien, menjadikannya pilihan utama untuk penelitian dan diagnostik molekuler di seluruh dunia. Instrumen ini dirancang khusus untuk menjalankan Elektroforesis Kapiler (CE) berkinerja tinggi, yang merupakan dasar dari metode Sekuensing Sanger (metode rantai terminasi) dan berbagai aplikasi Analisis Fragmen.
Kehadiran ABI 3100 menandai transisi signifikan dari mesin sekuensing berbasis gel pelat yang memakan waktu dan intensif tenaga kerja. Dengan kemampuan memproses empat sampel secara bersamaan dan sepenuhnya otomatis, 3100 secara drastis mengurangi waktu penyelesaian sampel, meningkatkan akurasi data melalui deteksi fluoresensi yang sensitif, dan mengoptimalkan penggunaan sumber daya laboratorium. Mesin ini menjadi kuda beban di banyak pusat sekuensing, memungkinkan proyek-proyek skala kecil hingga menengah, pengujian klinis rutin, dan penelitian genetik terfokus.
Fokus utama dari ABI 3100 adalah otomatisasi proses injeksi sampel, pemisahan fragmen DNA berlabel fluoresen melalui elektroforesis kapiler, dan deteksi sinyal optik multi-warna secara simultan. Kemampuannya mendukung seperangkat dye set yang kompleks memungkinkannya menjalankan protokol sekuensing dan analisis fragmen dengan presisi tinggi.
Inti dari fungsi abi3100 adalah teknologi Elektroforesis Kapiler (Capillary Electrophoresis/CE). CE adalah metode pemisahan molekul berdasarkan rasio massa-terhadap-muatan (M/Z) mereka. Dalam konteks analisis genetik, CE digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berbeda panjangnya, yang telah diberi label fluoresen.
Tidak seperti elektroforesis gel tradisional yang menggunakan gel agarosa atau poliakrilamida yang dituang secara manual, abi3100 menggunakan kapiler kaca tipis yang diisi dengan polimer matriks. Kapiler ini memiliki diameter internal yang sangat kecil (biasanya 50µm), yang menghasilkan disipasi panas yang sangat efisien. Disipasi panas yang baik sangat krusial karena memungkinkan penggunaan tegangan yang sangat tinggi (hingga 15 kV atau lebih) tanpa menyebabkan efek Joule Heating yang signifikan.
Peningkatan tegangan yang besar menghasilkan kecepatan elektroforesis yang sangat cepat dan resolusi yang superior. Ketika sampel DNA disuntikkan secara elektrokinetik ke ujung katoda kapiler, fragmen yang bermuatan negatif bergerak menuju anoda. Ukuran fragmenlah yang menentukan kecepatan pergerakan: fragmen DNA yang lebih pendek akan berinteraksi lebih sedikit dengan matriks polimer, sehingga bergerak lebih cepat, sedangkan fragmen yang lebih panjang akan tertinggal.
Polimer yang digunakan dalam abi3100 (seperti POP-4, POP-6, atau POP-7) bertindak sebagai "saringan" molekuler. Polimer ini adalah matriks berair yang dapat direplenish, yang berarti kapiler tidak perlu diisi ulang secara manual setelah setiap siklus—sebuah keuntungan besar dibandingkan sistem gel pelat. Pilihan polimer sangat mempengaruhi resolusi dan panjang baca (read length) yang dapat dicapai. POP-7, misalnya, sering digunakan untuk mencapai panjang baca maksimum dalam sekuensing.
Di ujung anoda (titik deteksi) setiap kapiler, abi3100 memiliki sistem laser dan optik yang canggih. Laser yang tereksitasi (biasanya laser Argon, 488 nm) memancarkan cahaya yang menyebabkan label fluoresen pada fragmen DNA memancarkan kembali cahaya pada panjang gelombang tertentu. Sistem optik, termasuk filter cermin dikroik dan perangkat pengisian daya (CCD) yang sensitif, menangkap cahaya emisi ini.
Karena setiap jenis dye (misalnya, FAM, TET, HEX, ROX) berfluoresensi pada spektrum yang berbeda, perangkat lunak ABI (seperti Data Collection Software) menggunakan proses yang disebut 'dekonvolusi' atau 'spektral kalibrasi' untuk memisahkan sinyal dari setiap dye, memungkinkan identifikasi basa yang berbeda (A, T, C, G) dalam sekuensing, atau alel yang berbeda dalam analisis fragmen.
ABI 3100 adalah sistem tertutup yang terintegrasi, terdiri dari beberapa modul yang bekerja secara harmonis untuk menjalankan analisis otomatis.
Ini adalah jantung fisik dari proses pemisahan. 3100 menggunakan array kapiler yang terdiri dari empat kapiler terikat, yang dirancang untuk diganti sebagai satu unit. Panjang kapiler bervariasi (misalnya 36 cm atau 50 cm), memengaruhi resolusi dan waktu lari.
3100 mengotomatiskan injeksi sampel. Ia mampu menangani pelat mikro 96-sumur. Robotika internal memindahkan ujung kapiler dari tempat penyimpanan buffer ke sumur sampel dan kemudian ke reservoir buffer polimer dan elektroforesis. Injeksi dilakukan menggunakan metode elektrokinetik, di mana tegangan tinggi diterapkan untuk menarik DNA bermuatan negatif ke dalam kapiler.
Instrumen ini memiliki pompa internal untuk mengisi ulang kapiler dengan polimer baru sebelum setiap lari (atau setiap beberapa lari). Kapiler dan elektroda ditempatkan dalam wadah yang berisi buffer elektrolit (biasanya buffer TAE atau TBE yang mengandung EDTA). Kebersihan dan kesegaran polimer dan buffer sangat penting untuk mencegah artefak seperti "spikes" atau panjang baca yang pendek.
Deteksi adalah fungsi laser Argon 488 nm. Sinar laser melewati jendela di array kapiler. Cahaya fluoresen yang dipancarkan oleh label dye dikumpulkan, dilewatkan melalui prisma atau kisi difraksi, dan difokuskan ke CCD (Charge-Coupled Device) atau fotodetektor. Keandalan modul optik adalah kunci keberhasilan dekonvolusi spektral.
Meskipun teknologi Sekuensing Generasi Berikutnya (NGS) telah mendominasi genomika skala besar, abi3100 tetap menjadi standar emas untuk sekuensing Sanger, terutama untuk validasi data, sekuensing fragmen tunggal, dan diagnostik klinis.
Metode Sanger memerlukan penggunaan didedoxynucleotide triphosphates (ddNTPs) yang dimodifikasi. Setiap ddNTP (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) berfungsi sebagai terminator rantai dan diberi label dengan pewarna fluoresen yang berbeda (misalnya, A=hijau, T=merah, C=biru, G=kuning/hitam).
Setelah reaksi PCR termal diselesaikan, menghasilkan ribuan fragmen DNA yang diakhiri secara spesifik, sampel disuntikkan ke abi3100. Saat fragmen bergerak melalui kapiler, mereka dipisahkan berdasarkan panjangnya. Ketika mereka melewati laser, terminator ddNTP terakhir pada setiap fragmen memancarkan warna yang unik, yang ditangkap oleh detektor.
Kualitas kromatogram yang dihasilkan oleh abi3100 adalah indikator utama keberhasilan. Puncak yang tajam, terpisah dengan baik, dan sinyal latar belakang yang rendah menunjukkan pemisahan yang efisien dan base calling yang andal. Kegagalan umum meliputi "dye blobs" (gumpalan pewarna) atau puncak yang melebar, seringkali disebabkan oleh pembersihan sampel yang tidak memadai.
Selain sekuensing, abi3100 adalah alat yang sangat kuat untuk Analisis Fragmen. Dalam aplikasi ini, tujuannya bukan untuk menentukan urutan basa, melainkan untuk mengukur panjang fragmen DNA dengan resolusi sangat tinggi (biasanya hingga 1 pasangan basa).
Dalam analisis fragmen, sampel diperbanyak menggunakan primer yang diberi label fluoresen. Fragmen yang dihasilkan dipisahkan melalui CE. Untuk mengukur panjang fragmen secara akurat, setiap sampel harus mengandung standar ukuran internal (Internal Lane Standard/ILS), seperti LIZ atau ROX. ILS ini terdiri dari fragmen DNA dengan panjang yang diketahui, diberi label dengan warna yang berbeda dari sampel, yang berfungsi sebagai jangkar kalibrasi dalam setiap kapiler.
Jangkauan aplikasi analisis fragmen pada abi3100 sangat luas:
Ini adalah aplikasi yang paling umum, digunakan dalam sidik jari DNA forensik, pengujian paternitas, dan studi genetik populasi. Mikrosatelit (Short Tandem Repeats/STRs) adalah urutan DNA berulang pendek yang sangat polimorfik. Menggunakan multiplex PCR, beberapa lokus STR dapat diperbanyak dalam satu tabung, dan fragmen yang dihasilkan dipisahkan berdasarkan panjangnya di abi3100.
Digunakan dalam penelitian kanker untuk membandingkan DNA tumor dengan DNA normal. LOH terdeteksi ketika salah satu alel mikrosatelit hilang dalam DNA tumor, mengindikasikan penghapusan kromosom.
Teknik ini digunakan untuk sidik jari genom dan studi keanekaragaman, terutama pada organisme yang genomnya tidak sepenuhnya diurutkan.
Meskipun bukan alat utama untuk pemindaian SNP skala besar, abi3100 digunakan untuk validasi SNP atau untuk teknik berbasis fragmen seperti minisequencing atau SNaPshot.
Mengoperasikan abi3100 secara efektif memerlukan pemahaman yang ketat tentang SOP untuk memaksimalkan umur komponen kritis dan meminimalkan waktu henti.
Setelah penyalaan, abi3100 melalui serangkaian pemeriksaan diagnostik internal. Penting untuk memastikan tingkat polimer dan buffer reservoir memadai. Reservoir buffer katoda dan anoda harus diisi ulang setiap hari atau setiap kali diganti dengan buffer baru, karena buffer cepat terdegradasi dan garam menumpuk akibat elektroforesis.
Sebelum menjalankan sampel, kalibrasi spektral harus dilakukan, terutama jika array kapiler atau batch polimer baru telah dipasang. Kalibrasi spektral melibatkan menjalankan sampel yang berisi semua pewarna yang akan digunakan, yang memungkinkan instrumen untuk membuat matriks dekonvolusi. Ini memastikan bahwa sinyal fluoresen tumpang tindih dari setiap pewarna dipisahkan secara akurat.
Pemeriksaan arus (current check) sangat vital. Arus yang stabil selama injeksi dan pemisahan menandakan bahwa kapiler tidak tersumbat dan koneksi listrik baik. Penurunan atau fluktuasi arus yang signifikan adalah sinyal peringatan pertama bahwa kapiler kotor atau polimer telah terdegradasi.
Sampel DNA harus dicampur dengan formamida berperingkat Hidi (Highly Deionized Formamide). Formamida berfungsi sebagai denaturant untuk menjaga DNA beruntai tunggal (SSDNA) selama elektroforesis. Kehadiran air atau garam dalam formamida dapat menyebabkan DNA beruntai ganda (dsDNA) terbentuk atau migrasi yang tidak stabil.
Prosedur standar melibatkan denaturasi termal (pemanasan hingga 95°C selama 3–5 menit) diikuti pendinginan cepat di atas es. Sampel harus segera dimuat ke mesin setelah denaturasi untuk mencegah renaturasi.
Karena abi3100 adalah sistem presisi dengan komponen yang rentan, jadwal pemeliharaan yang ketat sangat penting. Komponen yang paling mahal dan sering diganti adalah Array Kapiler.
Array kapiler memiliki umur terbatas, biasanya diukur dalam jumlah lari yang sukses (misalnya, 100 hingga 200 lari, tergantung panjang array dan jenis polimer). Polimer yang terdegradasi, penumpukan garam, atau penyumbatan kapiler akan mengurangi kualitas data.
Untuk memperpanjang umur array:
Sistem pompa bertanggung jawab untuk memuat polimer baru ke dalam kapiler. Katup dan segel pompa harus diperiksa secara berkala untuk kebocoran. Reservoir polimer harus dilindungi dari kontaminasi udara atau partikel, karena ini dapat menyumbat katup injeksi. Filter reservoir juga harus diganti sesuai jadwal.
Meskipun sistem optik laser dirancang agar kokoh, debu atau kondensasi pada jendela optik di dekat array kapiler dapat mengganggu deteksi sinyal. Pembersihan area jendela laser harus dilakukan dengan hati-hati hanya oleh personel terlatih, menggunakan kain bebas serat dan alkohol isopropil tingkat optik.
Data mentah yang keluar dari abi3100 adalah sinyal fluoresensi. Data ini harus diproses oleh perangkat lunak untuk diubah menjadi informasi genetik yang dapat diinterpretasikan.
DCS mengontrol instrumen selama proses lari. Ia menangkap data mentah (raw data) dalam format .DYE atau .ABI, yang mencakup profil mobilitas setiap fragmen dan intensitas sinyal untuk setiap warna fluoresen pada setiap titik waktu.
Perangkat lunak analisis sekuensing (misalnya, KB Basecaller) menggunakan algoritma yang kompleks untuk:
Kromatogram adalah representasi grafis dari data sekuensing. Idealnya, puncak harus seragam dalam ketinggian, memiliki lebar yang konsisten, dan terpisah dengan jelas. Masalah umum yang diidentifikasi melalui kromatogram meliputi:
Dalam lingkungan laboratorium yang sibuk, masalah pada instrumen 3100 pasti terjadi. Diagnosis yang cepat dan akurat dapat menyelamatkan waktu dan biaya reagen yang besar. Troubleshooting pada sistem 3100 umumnya terbagi menjadi tiga kategori: Kapiler/Polimer, Listrik/Injeksi, dan Optik/Laser.
Gejala: Panjang baca sekuensing sangat pendek (misalnya kurang dari 300 bp), atau puncak analisis fragmen tidak terpisah dengan baik (stuttering).
Penyebab Utama:
Gejala: Tidak ada sinyal (blank run) atau sinyal sangat lemah; arus elektroforesis sangat rendah atau nol selama lari.
Penyebab Utama:
Gejala: Semua kromatogram menunjukkan sinyal di semua empat warna (crosstalk) atau warna yang salah dominan; matriks spektral gagal.
Penyebab Utama:
Dalam dekade-dekade berikutnya setelah rilisnya, abi3100 telah digantikan oleh model yang lebih baru dan berkapasitas lebih tinggi, seperti 3730xl (96 kapiler) dan seri 3500 (8/24 kapiler). Namun, abi3100 memegang peranan penting sebagai jembatan teknologi.
Perbedaan utama terletak pada throughput. 3730xl, dengan 96 kapiler, secara eksponensial lebih cepat. Namun, 3100 seringkali lebih disukai di laboratorium kecil atau untuk pengujian klinis yang membutuhkan fleksibilitas sampel rendah hingga menengah. Biaya operasional 3100 (terutama biaya array kapiler) seringkali lebih rendah per array, meskipun biaya per sampelnya lebih tinggi dibandingkan 3730xl.
Seri 3500 menawarkan modularitas, sistem injeksi polimer yang disempurnakan (dengan polimer yang siap pakai dalam bentuk kantung), dan antarmuka perangkat lunak yang lebih modern. 3500 juga menggunakan laser yang lebih awet dan lebih aman (laser solid-state hijau 505 nm) dibandingkan laser Argon 3100. Meskipun demikian, 3100 tetap dipertahankan di banyak tempat karena desainnya yang sangat tangguh dan kemudahan relatif dalam pemeliharaan mekanisnya.
Abi3100 terkenal karena keandalannya yang luar biasa; banyak unit yang terus beroperasi dengan baik di seluruh dunia, membuktikan kualitas rekayasa Applied Biosystems. Kemampuan untuk menggunakan reagen pihak ketiga atau reagen buatan sendiri untuk polimer dan buffer juga meningkatkan daya tarik ekonomis jangka panjangnya, terutama di fasilitas dengan anggaran terbatas.
Salah satu fitur yang memastikan abi3100 tetap relevan adalah kontrolnya yang ketat terhadap lingkungan elektroforesis. Kecepatan migrasi fragmen DNA tidak hanya dipengaruhi oleh panjangnya, tetapi juga oleh viskositas dan suhu polimer.
Polimer yang digunakan dalam CE harus memiliki viskositas yang tepat. Jika terlalu encer, resolusi akan menurun; jika terlalu kental, tekanan balik saat mengisi ulang kapiler akan meningkat, berpotensi merusak array atau pompa. Konsentrasi polimer (misalnya 4%, 5%, atau 6% POP) dan jenisnya (POP-4, POP-6, POP-7) secara langsung dikorelasikan dengan ukuran fragmen DNA yang dapat dipisahkan dan resolusi pemisahan yang dihasilkan. Penggunaan POP-7 sering dipilih untuk Sekuensing Sanger karena memungkinkan pemisahan fragmen yang sangat panjang, sedangkan POP-4 mungkin lebih disukai untuk beberapa aplikasi analisis fragmen yang memerlukan waktu lari cepat.
Stabilitas suhu oven adalah kritis absolut. Kenaikan suhu sebesar satu derajat Celsius dapat mengubah mobilitas DNA secara substansial. ABI 3100 menggunakan oven termoelektrik yang canggih untuk menjaga suhu lari pada nilai yang ditentukan (misalnya 60°C) dengan fluktuasi minimal. Suhu yang tinggi diperlukan untuk memastikan DNA tetap dalam konfigurasi untai tunggal (denaturasi) saat melewati matriks polimer, mencegah artefak dan pemisahan ganda yang merusak base calling.
Kegagalan termal pada oven, meskipun jarang, akan menyebabkan hasil lari yang tidak konsisten dan tidak dapat direproduksi. Ini seringkali didiagnosis ketika fragmen yang sama menunjukkan waktu migrasi yang berbeda secara signifikan antar lari.
Integrasi abi3100 ke dalam alur kerja laboratorium tidak hanya meningkatkan kecepatan, tetapi juga memaksa standarisasi yang lebih tinggi.
Untuk memanfaatkan kapasitas 4-kapilernya, laboratorium didorong untuk menstandarisasi reagen dye terminator dan kit analisis fragmen mereka. Ini termasuk penggunaan kit komersial berstandar tinggi dan pengujian kualitas yang ketat pada setiap batch reagen yang masuk. Kesalahan pada satu sumur karena kontaminasi reagen berpotensi memengaruhi lari berikutnya jika tidak segera ditangani.
Meskipun operasi instrumen itu sendiri otomatis, keberhasilan proyek abi3100 sangat bergantung pada keahlian bioinformatika sekunder. Seorang operator harus mahir dalam:
Kompleksitas perangkat lunak analisis, seperti GeneMapper untuk analisis fragmen, membutuhkan pelatihan khusus. GeneMapper memungkinkan perbandingan otomatis antara sampel dengan standar alel dan genotipe, sebuah langkah penting dalam forensik dan diagnostik klinis yang sangat mengandalkan abi3100.
Proses di mana sampel DNA ditarik ke dalam kapiler adalah injeksi elektrokinetik, sebuah langkah yang sangat sensitif terhadap kondisi sampel. Abi3100 memungkinkan operator untuk menyesuaikan parameter injeksi untuk mengoptimalkan hasil.
Injeksi elektrokinetik bergantung pada tegangan yang diterapkan (kV) dan durasi (detik).
Optimasi injeksi selalu merupakan kompromi antara intensitas sinyal dan resolusi. Protokol standar Applied Biosystems memberikan titik awal (misalnya 15kV selama 15 detik), tetapi penyesuaian mungkin diperlukan untuk sampel yang sangat encer atau sangat pekat.
Formamida (HiDi) bukan hanya denaturant; ia juga memengaruhi viskositas sampel. Viskositas sampel harus serendah mungkin untuk memfasilitasi injeksi yang cepat dan efisien. Penting bahwa rasio sampel DNA terhadap formamida dipertahankan secara ketat sesuai protokol, dan formamida harus bebas dari ion garam atau kontaminan lainnya yang dapat menarik arus elektroforesis secara berlebihan.
Ketika garam terlalu banyak, injeksi akan menarik lebih banyak ion garam daripada molekul DNA, mengakibatkan sinyal DNA yang sangat rendah. Efek ini adalah salah satu penyebab paling umum kegagalan pada lari abi3100.
Warisan abi3100 tidak hanya terletak pada teknologinya, tetapi juga pada kontribusinya terhadap studi genetik spesifik.
Dalam diagnostik klinis, abi3100 memainkan peran kunci dalam sekuensing gen target untuk identifikasi strain mikroba, penentuan resistensi obat (misalnya, mutasi pada gen target HIV), dan analisis genotipe virus. Kecepatan dan ketepatan Sekuensing Sanger yang ditawarkan oleh 3100 menjadikannya ideal untuk konfirmasi cepat mutasi klinis penting.
Sistem STR 4-kapiler telah menjadi tulang punggung identifikasi forensik di banyak negara. Keakuratan pengukuran panjang fragmen yang mencapai resolusi satu pasang basa memungkinkan pencocokan profil DNA yang sempurna. Protokol yang digunakan pada abi3100 menjadi dasar untuk sistem basis data DNA nasional, seperti CODIS di AS dan set standar internasional lainnya.
Kemampuannya untuk memisahkan hingga lima dye color (empat untuk DNA + satu untuk standar internal) memungkinkan multiplexing tingkat tinggi, di mana lebih dari 15 lokus STR dapat dianalisis dalam satu sumur, mengoptimalkan waktu dan biaya reagen.
Applied Biosystems abi3100 Genetic Analyzer adalah penentu era transisi dalam biologi molekuler. Ia mengambil prinsip-prinsip Sekuensing Sanger dan elektroforesis fragmen yang sudah mapan dan menyuntikkannya dengan otomatisasi yang diperlukan untuk throughput modern.
Sebagai sistem 4-kapiler yang tangguh, 3100 telah memungkinkan ribuan proyek penelitian, mempercepat diagnosis genetik, dan menstandarisasi metodologi forensik di seluruh dunia. Meskipun instrumen yang lebih baru telah meningkatkan throughput, abi3100 tetap dihormati sebagai platform yang andal, akurat, dan memiliki desain yang memungkinkan pemeliharaan yang relatif mudah. Kontribusinya terhadap pemahaman genom manusia dan organisme lain adalah warisan yang tak ternilai dalam sejarah instrumental biologi molekuler.